2.1. Материалы исследований

Материалом для исследований служили образцы периферической крови больных фенилкетонурией, членов их семей, доноров из разных регионов Украины, пациентов, включенных в программу генетического тестирования, а также материалом для исследования служили биоптаты хориона, плаценты и некультивированные клетки амниотической жидкости, полученные от беременных из этих семей в ходе пренатальной ДНК-диагностики.

Образцы крови пациентов, включенных в программу генетического тестирования, были предоставлены клиникой “Исида- IVF” (г. Киев).

Для выделения ДНК в работе были использованы следующие реактивы:  желатин, протеиназа К, додецилсульфат натрия, TRITON X-100, этилендиаминтетрааминуксусная кислота производства фирмы "SIGMA"; сахароза, перхлорат натрия, магния хлорид, этанол, изопропанол, хлороформ, фенол, натрия хлорид отечественного производства марок ЧДА и ОСЧ.

Олигонуклеотидные праймеры для полимеразной цепной реакции, гомологичные нуклеотидным последовательностям гена ФАГ были синтезированы в Институте биоорганической химии РАН (Москва) и на фирмах Amersham, Pharmacia Biotech (Австрия), Genosys (Великобритания), MWG Biotech AG (Великобритания).

Использовалась термостабильная Taq- полимераза производства "Биокон" (г. Москва, Россия), Fermentas (Литва).

Наборы дезоксинуклеотидтрифосфатов производства "Биокон" (г. Москва,  Россия) и Amersham, Pharmacia Biotech (Австрия).

 Рестрицирующие эндонуклеазы MspI, Eco1301, MnlI, RsaI, Eco881, BamHI, Sau3A, HinfI, фирмы Fermentas (Вильнюс, Литва), а также DdeI фирмы Amersham, Pharmacia Biotech (Австрия) .

“ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequincing Ready Reaction Kits” производства компании “PE Biosystem” был использован при проведении реакции секвенирования.

TRIS (гидроксиметиламинометан), ТАЕ, акриламид, бисакриламид, мочевина, агароза, этидиум бромид, формамид, бромфеноловий синий, ксиленцианол  производства фирмы "SIGMA"; TEMED (N,N,N,N'-тетраметилетилендиамин) производства фирмы "REANAL"; ТЕАА (триэтиламин ацетат), ацетонитрил производства фирмы “Lennox” были использованы при фракционировании ПЦР продуктов методами электрофореза и хроматографии.

Остальные реактивы отечественного производства марок ОСЧ и ЧДА.

2.2. Методы исследований

2.2.1. Выделение и очистка ДНК

2.2.1.1. Выделение и очистка лейкоцитарной ДНК из образцов свежей крови

ДНК из образцов свежей крови, выделяли по методу, предложенному авторами из Германии [70]. Для разделения лейкоцитарной и эритроцитарной фракций к известным объемам крови (8-10 мл) со стандартным консервантом глюгициром приливали равный объем раствора, содержащего 3,5% желатина и 0,8% NaCl. Затем смеси давали расслоиться в узком цилиндре и пипеткой отбирали светлый верхний слой, содержащий взвесь лейкоцитов. После этого взвесь переносили в центрифужный стакан, добавляли равный объем физиологического раствора (0,8% NaCl) и центрифугировали при 3000 g 10 минут. Осадок клеток ресуспендировали, добавляли 100 мл физраствора (0,8% NaCl), центрифугировали повторно. Затем осадок лейкоцитов ресуспендировали в 2 мл физраствора (на 10 мл крови) и прибавляли 2 мл 0,5М ЭДТА (рН 8,0). После этого лизировали клетки добавлением раствора додецилсульфата натрия (SDS) до конечной концентрации 1%. Для осаждения белков к лизату добавляли раствор перхлората натрия до конечной концентрации 1,2М. Депротеинизацию лизата осуществляли добавлением равного объема смеси хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1) и плавным помешиванием в течении 10 минут с последующим центрифугированием при 3000 g 15 минут. После центрифугирования отбирали водную фазу и повторяли процедуру депротеинизации 2-3 раза до исчезновения интерфазы. Затем к очищенному лизату медленно добавляли 0,6-0,8 объема изопропилового спирта и осадок ДНК выматывали на стеклянную палочку. После этого промывали осадок ДНК на палочке 70%-ным этанолом, подсушивали и растворяли в небольшом  количестве  (2-3 мл) деионизированной воды. После полного растворения ДНК переосаждали двумя объемами холодного 96% этилового спирта,  предварительно добавив NaCl до конечной концентрации 0,1М. После подсушивания осадок растворяли в 0,1ХSSCили деионизированной воде. Качество препаратов ДНК  оценивали методом электрофореза в 0,6%-ном агарозном мини-геле.

2.2.1.2. Выделение ДНК из образцов крови длительного хранения, а также некультивированных клеток амниотической жидкости, хориона и плаценты. 

ДНК из лейкоцитов крови с большими сроками давности (2-5 суток), некультивированных клеток амниотической жидкости, хориона и плаценты выделяли - путем гидролиза лизатов клеток протеиназой К с последующей фенол-хлороформной экстракцией [71]. В случае выделения ДНК из крови к известному объему (1-10 мл) охлажденной при температуре +4˚С крови для лизиса лейкоцитов прибавляли 7-9 объемов холодного буфера,  содержащего 5 мМ МgCl₂, 0,10 мМ ТРИС-НСl (pH 8,0),  1% Тритон Х-100, 0,32 М сахарозы и осаждали ядра путем центрифугирования при 2500g при температуре +4˚С в течение 15 минут. Осадок ядер ресуспендировали в 500-700 мкл (при выделении ДНК из 5-10 мл крови) буфера, содержащего 100 мМ NaCl,  10 мМ ТРИС-НСl (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА (рН 8,0). Затем добавляли 10%-ный раствор SDS до конечной концентрации 0,5% и протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/мл. После инкубации лизатов ядер в течении 4 часов при 55⁰С или 12-16 часов при температуре 37⁰С осуществляли их депротеинизацию путем последовательной экстракции фенолом (рН 8,0) забуференном Tris-HCl, смесью равных объемов фенола с хлороформом и хлороформом до исчезновения интерфазы после центрифугирования. Осадок ДНК получали добавлением к очищенной водной фазе 2-2,5 объемов холодного 96% этилового спирта, промывали 70%-ным этиловым спиртом, подсушивали и растворяли в деионизированной воде.

Процедура выделения ДНК из клеток плода отличалась от вышеописанной отсутствием первого этапа – центрифугирования с сахарозным буфером.

Качество препаратов ДНК определяли методом электрофореза в 0,6%-ном агарозном геле.

2.2.2. Амплификация некоторых последовательностей гена ФАГ методом полимеразной цепной реакции

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в автоматическом режиме на термоциклере "Perkin Elmer" (фирма "Cetus", США). Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала:

- ТРИС-НСl – 67 мМ (рН 8,8 при 25⁰С);

- (NH₄)₂SO₄ – 16,7 мМ;

- b-меркаптоэтанол – 10 мМ;

- ЭДТА – 6,7 мкМ;

- MgCl₂ – 2,5-3 mM;

- Бычий сывороточный альбумин – 170 мкг/мл;

- dNTP – по 400 мкМ каждого типа;

- ДНК – 1 мкг матрицы;

- термостабильная ДНК-полимераза – 0,5 единиц активности;

- олигонуклеотидные праймеры – по 110^–3 оптических единиц каждого.

Далее в пробирку добавляли по 20 мкл вазелинового масла для предотвращения испарения образцов и помещали пробирки в термоциклер. В зависимости от состава нуклеотидных оснований и размера амплифицируемого фрагмента использовались различные программы проведения полимеразной цепной реакции, включающие в себя три основных этапа: денатурация ДНК, отжиг праймеров, синтез ДНК. Для R408W, IVS12nt1, Y414C, IVS10nt546 использовался следующий температурный цикл:

1) предварительная денатурация 4 мин при температуре 94ºС;

2) 30 циклов каждый состоит из трех этапов (2.1 – 2.3);

2.1) денатурация ДНК – 94 ºС на протяжении 40 с; 

2.2) отжиг праймеров проводился при температуре 57 ºС на протяжении 40с.

2.3) элонгация - 72 ºС на протяжении 40 с.,

3) элонгация - 72ºС на протяжении 7 мин.

Для R158Q использовался следующий температурный цикл:

1) предварительная денатурация 4 мин при температуре 94ºС;

2) 30 циклов каждый состоит из трех этапов (2.1 – 2.3);

2.1) денатурация ДНК – 94 ºС на протяжении 50 с; 

2.2) отжиг праймеров - 60 ºС на протяжении 50 с.

2.3) элонгация - 72 ºС на протяжении 50 с.,

3) элонгация - 72ºС на протяжении 7 мин.

Для амплификации седьмрго экзона использовался следующий температурный цикл:

1) предварительная денатурация 5 мин при температуре 94ºС;

2) 5 циклов каждый состоит из трех этапов (2.1 – 2.3);

2.1) денатурация ДНК – 94 ºС на протяжении 40 с; 

2.2) отжиг праймеров - 59 ºС на протяжении 40 с.

2.3) отжиг праймеров - 61 ºС на протяжении 40 с.

2.4) элонгация 72 ºС на протяжении 50 с.,

3) 30 циклов каждый состоит из трех этапов (3.1 – 3.3);

3.1) денатурация ДНК – 94 ºС на протяжении 40 с;

3.2) отжиг праймеров - 57 ºС на протяжении 45 с.

3.3) отжиг праймеров - 59 ºС на протяжении 20 с.

3.4) отжиг праймеров - 60 ºС на протяжении 20 с.

3.5) элонгация 72 ºС на протяжении 50 с.,

4) элонгация 72ºС на протяжении 7 мин.

После 30 - 35 циклов амплификации образцы выдерживали в течении 10 минут при температуре 70⁰С и охлаждали при комнатной температуре. При необходимости синтезированные продукты ПЦР хранили до 2-х месяцев при +4⁰С.

2.2.3. Идентификация мутаций методом рестрикционного анализа

2.2.3.1. Амплификация in vitro последовательностей гена ФАГ для последующего рестрикционного анализа

 Данный метод анализа нуклеотидной последовательности основан на амплификации in vitro фрагмента ДНК гена, фланкирующего участок локализации мутации с последующей обработкой продукта ПЦР эндонуклеазой рестрикции, сайт узнавания для которой появляется или исчезает в результате мутации. В тех случаях, когда не удается подобрать рестриктазу для такого анализа, используется один из вариантов метода полимеразной цепной реакции – метод сайт направленного мутагенеза. Один из праймеров, используемых при методе сайт направленного мутагенеза несет на 3`-конце единичную нуклеотидную замену, позволяющую создать сайт рестрикции в нормальной или мутантной последовательности. Полимеразная цепная реакция проводилась по основной схеме описанной в разделе 2.2.2. В таблице 2.1 приведены последовательности и температура отжига олигонуклеотидных праймеров, использовавшихся для амплификации экзонных и интронных последовательностей гена ФАГ. 

Таблица 2.1. Последовательности олигонуклеотидных праймеров и особенности проведения ПЦР для последующего рестрикционного анализа мутаций гена ФАГ.

2.2.3.2. Рестрикционный анализ

Для проведения рестрикционного анализа к продуктам ПЦР объемом 10 –20 мкл (в зависимости от концентрации продукта) добавляли 1 – 10 единиц активности соответствующей эндонуклеазы рестрикции (таблица 2.2) и инкубировали смесь 2 – 16 часов при температуре +37 ⁰С, во всех случаях за исключением рестриктазы Eco881, для которой инкубацию проводили при температуре +4 ⁰С. Продукты рестрикции анализировали в 1,8% агарозном геле. В качестве маркера молекулярной массы использовали 100 Base-Pair Ladder (фирма "Pharmacia"). Гели окрашивали бромистым этидиумом и сканировали на УФ-трансиллюминаторе.

Таблица 2.2.

Условия проведения анализа мутаций гена ФАГ методом рестрикционного анализа

+ сайт рестрикции создается при мутации; - сайт рестрикции исчезает при мутации

* размер рестрикционных фрагментов в «нормальной» последовательности ДНК

** размер рестрикционных фрагментов при мутации

2.2.4. Анализ полиморфных последовательностей ДНК гена ФАГ

2.2.4.1. Анализ аллельных вариантов VNTR-локуса 3`-нетранслируемого участка гена ФАГ

Для анализа аллельных вариантов VNTR-локуса гена ФАГ проводили амплификацию in vitro специфической последовательности ДНК этого локуса с использованием олигонуклеотидных праймеров, приведенных в таблице 2.3 [72]. Полимеразная цепная реакция проводилась при условиях описанных в разделе 2.2.2.

Таблица 2.3.  Последовательности олигонуклеотидных праймеров, использованных для амплификации in vitro методом ПЦР VNTR-локуса гена ФАГ

Амплификация проводилась с использованием термоциклеров «Ампли-2» и «Ампли-3» по следующей программе:

1 цикл  94 ^о С – 4 мин

3  цикла    94  ^оС – 36 сек. (денатурация)

            57  ^оС – 45 сек (отжиг праймеров)

            71  ^оС – 45 сек (синтез)

26 циклов 94  ^оС – 36 сек (денатурация)

            53  ^оС – 30 сек (отжиг праймеров)

            58  ^оС – 42 сек (отжиг праймеров)

            65 ^о С – 90 сек (синтез)

Продукты ПЦР анализировали после их фракционирования в 1,8% агарозном геле. Гели окрашивали бромистым этидием и сканировали на УФ-трансиллюминаторе. В качестве маркера молекулярной массы использовали ДНК плазмиды pBR322, гидролизованой эндонуклеазой рестрикции HaeIII. 

2.2.4.2. Анализ аллельных вариантов STR-локуса (3-й интрон) гена ФАГ

Для анализа аллельных вариантов STR-полиморфизма гена ФАГ проводили амплификацию in vitro специфической последовательности ДНК с использованием олигонуклеотидных праймеров, приведенных в таблице 2.4 [73]. Полимеразная цепная реакция проводилась при условиях описанных в разделе 2.2.2.

Таблица 2.4. Последовательности олигонуклеотидных праймеров, использованных для амплификации in vitro методом ПЦР STR-локуса гена ФАГ

Название праймера	Нуклеотидная последовательность
STR a	5'- GCCAGAACAACTACTGGTTC-3'
STR b	5'-  AATCATAAGTGTTCCCAGAC-3'

Продукты ПЦР соответствующие аллельным вариантам STR-локуса анализировали с использованием автоматического лазерного флюориметра “ALF express” производства компании “Pharmacia Biotech”. Один из праймеров, приведенных в таблице 2.8 метили флюоресцентной меткой Cy5. Аликвоту ПЦР продукта (объем 1 мкл) смешивали с 3-мя мкл раствора для нанесения на гель. В состав раствора входили: формамид (95%), декстран синий (5 мг/мл) и два «внутренних» маркера меченных флюоресцентной меткой Cy5 определенного  размера. Приготовленную смесь денатурировали в течении 3-х минут при температуре 95 ^оС и резко охлаждали, после чего наносили на ALF-гель, который содержал 8% акриламид/бисакриламид, 0,6ХТВЕ и 7 М мочевины. Электрофорез проводили при следующих условиях: температура - 45 ^оС, напряжение – 1000 V, сила тока – 50 мА, время – 90 минут. После сканирования данные обрабатывали с помощью программы FM2.1 (Fragment Manager Software V2.1, Pharmacia).